CRISPR-Cas9基因編輯技術具有廣泛的潛在未來應用，包括癌癥治療_[1]。目前，CRISPR-Cas9技術的主要安全性問題是宿主對其組分的免疫反應_[2-3]和脫靶問題_[4]。然而，該技術在RNA水平的安全性問題尚未得到評估。
 

RNA和MicroRNAs(miRNAs)之間存在廣泛的相互作用，不僅發(fā)生在mRNA的3’非翻譯區(qū)域，也發(fā)生在mRNA的氨基酸編碼序列(CDSs)中_[5]。越來越多的研究發(fā)現，一種長鏈RNA可以通過“miRNA海綿”機制結合和吸附與其部分互補的miRNA，上調被這些miRNA抑制的靶基因_[6]。
 

近期，海軍軍醫(yī)大學王越團隊、上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院秦興軍/王業(yè)飛團隊與美國南加州大學應其龍團隊合作在Molecular Cancer雜志上發(fā)表題為Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNA sponge的文章，文中研究了外源性長鏈核酸物質Cas9 RNA是否會通過miRNA海綿機制影響宿主細胞基因表達，并開發(fā)了RNA序列優(yōu)化策略，以提高該基因編輯系統(tǒng)的安全性_[7]。

結果

01  Cas9 RNA通過miRNA海綿機制影響細胞內基因表達
 

為了分析Cas9對其細胞內本身存在的microRNAs及其靶基因的調控作用，研究人員首先挖掘了一個數據庫，其中包含過表達Cas9及其對應親本對照的331個細胞系的轉錄組信息。作者使用miRanda軟件分析了Cas9 RNA和所有已知的人類miRNA之間的結合可能性。
 

研究人員將預測與Cas9 RNA結合可能性最高的51個miRNAs被命名“Cas9-miRNAs”(圖1A-B)，而69個不與Cas9結合的miRNAs被命名為“non-Cas9-miRNAs”。根據microRNA海綿假說，在某種細胞中引入Cas9后，某“Cas9-miRNA”的靶基因中，可能存在有更多靶基因表達水平上調的趨勢。研究者發(fā)現在這331個細胞系中，大多數“Cas9-miRNAs”的靶基因在更多的細胞中存在上述趨勢，符合microRNA海綿假說；而“non-Cas9-miRNAs”的靶基因就不存在這樣的趨勢。這個結果從CRISPR研究領域上講，提示Cas9的RNA可以通過microRNA海綿機制發(fā)揮作用；從RNA相互作用的的基礎機制角度上講，該研究利用幾百種細胞系中，單一的，相同干預設計的大樣本數據證明了microRNA海綿機制本身的普遍性，雖然在很多細胞中這種效應并不是非常強。
 

在聯合分析miRNA基礎表達數據庫（CCLE）中的數據后，研究者發(fā)現在所有的Cas9-miRNA中，Let-7i是大多數細胞中主要表達的Cas9-miRNA。且Let-7家族成員是眾所周知的腫瘤抑制miRNA，因此研究者后續(xù)研究將注意力集中在了Cas9的RNA對let-7家族及其下游靶基因的研究中。通過qPCR和Western Blot實驗，研究人員證實了在更多類型的細胞中引入Cas9后，一些驗證過的let-7靶基因表達上調(U251, 786-O, T98G v.s. MCF7) (圖1I-J) 。
 

此外，研究者還將let-7i的靶基因變化符合microRNA海綿假說趨勢的細胞定義為let-7i相關Cas9敏感細胞，反之為let-7i相關Cas9不敏感細胞；對比這兩類細胞發(fā)現，miRNA本身的表達量和靶基因的基礎表達量，以及靶基因的突變狀態(tài)都會影響Cas9的RNA發(fā)揮microRNA海綿效應。這不僅有助于評價Cas9在某種細胞中是否通過microRNA海綿效應發(fā)揮作用，也為更廣泛的microRNA海綿效應是否存在于某種細胞提供一定預判參考。
 

進一步，作者分析了其他幾種Cas9 RNA通過microRNA海綿機制參與let-7家族靶基因的調控，通過RNA-pulldown實驗證實Cas9 RNA可以直接結合let-7(圖1N)，并且證實在一些腫瘤細胞中，一些let-7靶基因在Cas9導入后有一定程度上調，如CDK6、KRAS、FN1和HMGA(圖1O)。在Cas9轉基因小鼠中，雖然在大多數作者檢測的組織中沒發(fā)現顯著差異，但在少數組織中存在let-7靶基因上調的現象。以上實驗結果表明，Cas9 RNA在某些類型的細胞中可以通過miRNA海綿機制調控let-7靶基因，提示Cas9表達系統(tǒng)本身可能通過DNA裂解以外的機制影響細胞。
 

圖1 Cas9 RNA通過miRNA海綿機制影響細胞內基因表達

02  Cas9 RNA序列優(yōu)化降低其對細胞增殖和let?7下游基因的影響
 

Let-7下游靶基因大部分為癌基因，由于Cas9可以調控一些let-7靶基因的表達，研究人員推測外源引入Cas9可能會影響細胞的生物學特性。作者將Cas9病毒載體和對照病毒轉入人前列腺癌細胞系DU145，發(fā)現Cas9在細胞計數中輕度促進細胞增殖和細胞集落形成（圖1A）。在體內實驗中，研究人員也發(fā)現Cas9輕度促進腫瘤細胞的生長(圖2B)。
 

Cas9 RNA可以通過miRNA海綿機制輕微促進某些細胞的增殖，提示除了降低CRISPR-Cas9系統(tǒng)的脫靶效應外，有必要通過修改Cas9本身的RNA來提高CRISPR-Cas9技術的安全性。為了進一步證實這一miRNA海綿機制的存在且在RNA水平上優(yōu)化Cas9序列，研究人員構建了一個同義突變質粒Cas9-Mut，在三個let-7結合位點發(fā)生突變，而Cas9-mut的mRNA轉錄本可以被翻譯成與Cas9相同的氨基酸序列(圖2F)。HEK293細胞的RNA-pulldown實驗顯示，Cas9-mut與let-7的結合比Cas9明顯減少(圖2G)。
 

研究人員發(fā)現，在DU145細胞(圖2J-K)和U251細胞中(圖2L)，Cas9-mut上調let-7靶基因的能力也明顯弱于Cas9。研究者將Cas9-Mut質：桶邢騏BXN4基因的gRNA轉入DU145細胞，進一步測試證實了Cas9-Mut的基因編輯能力(圖2O)，為其在實際應用中提供了支持。
 

圖2Cas9 RNA序列優(yōu)化降低其對細胞增殖和let?7下游基因的影響

結論

研究人員通過生物信息學分析和實驗結果表明，Cas9的RNA可以通過miRNA海綿機制與內源性miRNA相互作用，Cas9 RNA可以通過結合let-7，上調一些let-7的靶基因，并在某些細胞類型中輕度促進細胞增殖。通過同義突變let-7結合位點，可以優(yōu)化Cas9的RNA序列，削弱其對細胞增殖和部分let-7下游基因的表達的促進作用。研究者從新的維度認識了CRISPR/Cas9技術的安全性問題，并提出了解決方案，提供了在RNA水平上優(yōu)化的更安全的CRISPR/Cas9技術， 有一定的應用前景。


海軍軍醫(yī)大學的蔣俊鋒，曾韜，張莉和范杏飛為文章的第一作者。
 

參考文獻：

[1]Zhang H, et al. Application of the CRISPR/Cas9-based gene editing technique in basic research, diagnosis, and therapy of cancer. Mol Cancer.2021;20(1):126.

[2] Chew WL, et al. A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response.Nat Methods. 2016;13(10):868–74.

[3]Charlesworth CT, et al. Identification of preexisting adaptive immunity toCas9 proteins in humans. Nat Med. 2019;25(2):249–54.

[4]Kleinstiver BP, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleaseswith no detectable genome-wide off-target effects. Nature.2016;529(7587):490–5.

[5]Tay Y, et al. MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulateembryonic stem cell differentiation. Nature. 2008;455(7216):1124–8.

[6]Xiao G, et al. The long noncoding RNA TTTY15, which is located on the Ychromosome, promotes prostate Cancer progression by sponging let-7.Eur Urol. 2019;76(3):315–26.

[7]Junfeng Jiang,et al.Optimization of Cas9 RNA sequenceto reduce its unexpected effects as a microRNAsponge.Mol Cancer.2022 Jun 24;21(1):136.doi: 10.1186/s12943-022-01604-x.