有“毒”？?jī)?nèi)毒素—rAAV載體的“毒”中“毒”
什么是內(nèi)毒素？
內(nèi)毒素(Endotoxin)：又稱脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)，由脂質(zhì)A、菌體特異性多糖和非特異性核心多糖三部分構(gòu)成，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外壁的組成成分，單位EU/mL。內(nèi)毒素對(duì)宿主是有毒性的，脂質(zhì)A是內(nèi)毒素的主要毒性組分。
圖1 內(nèi)毒素分子結(jié)構(gòu)（紫色方框所示,圖片來源參考文獻(xiàn)4）
rAAV載體中為什么會(huì)含有內(nèi)毒素？
內(nèi)毒素的釋放是由細(xì)菌死亡自溶或粘附在其他細(xì)胞時(shí)造成的，也會(huì)發(fā)生在正常細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂過程中。在rAAV載體制備過程中，內(nèi)毒素污染主要有兩種來源：細(xì)菌內(nèi)毒素和環(huán)境內(nèi)毒素。由于rAAV生產(chǎn)所需要的質(zhì)粒DNA是從大腸桿菌中分離提取的，因此質(zhì)粒DNA可能含有少量?jī)?nèi)毒素；同時(shí)，rAAV制備過程中需轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，而細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂可能也會(huì)帶來內(nèi)毒素的產(chǎn)生；此外，生產(chǎn)過程中的環(huán)境污染可能亦會(huì)引入內(nèi)毒素。
rAAV載體中的內(nèi)毒素如何檢測(cè)？
根據(jù)藥物生產(chǎn)的規(guī)范要求，基于鱟試劑的內(nèi)毒素測(cè)定是檢測(cè)內(nèi)毒素殘留的金標(biāo)準(zhǔn)。鱟是一種海洋節(jié)肢動(dòng)物，身體呈青褐色，血液呈淡藍(lán)色，鱟的血液一遇到細(xì)菌就會(huì)凝固。因此，人們利用這一特點(diǎn)開發(fā)出鱟試劑，即將鱟血液中的變形細(xì)胞進(jìn)行溶解，將溶解物制成含有能被微量?jī)?nèi)毒素激活的凝固酶原產(chǎn)品，通過判斷內(nèi)毒素導(dǎo)致的渾濁效應(yīng)測(cè)試內(nèi)毒素含量。
通常，鱟試劑變性細(xì)胞溶液交聯(lián)測(cè)定的敏感度是0.06個(gè)單位的內(nèi)毒素EU/mL。測(cè)試樣品用重蒸水兩倍稀釋使用，測(cè)定試劑（11uL）加入到rAAV溶液，培養(yǎng)在37℃，60min，試管檢測(cè)膠塊的出現(xiàn)，檢測(cè)陽性和陰性結(jié)果。
內(nèi)毒素對(duì)宿主的影響
內(nèi)毒素對(duì)宿主是有毒性的，即使是少量的內(nèi)毒素也可能會(huì)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生免疫反應(yīng)。內(nèi)毒素可以與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合引起免疫反應(yīng)，激活組織內(nèi)的炎性細(xì)胞和炎癥因子的釋放，對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性作用，影響體內(nèi)外細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能。在體內(nèi)環(huán)境下，內(nèi)毒素作用于哺乳動(dòng)物，可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱，引發(fā)全身性炎癥反應(yīng)，繼而引起彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多臟器功能衰減等，最終導(dǎo)致死亡。因此，無論是涉及病毒載體的實(shí)驗(yàn)研究還是臨床應(yīng)用，九游會(huì)j9都需要盡量去除載體的內(nèi)毒素。
如何有效去除rAAV載體中內(nèi)毒素
在病毒的生產(chǎn)中，內(nèi)毒素的去除包括親和層析、緩沖液洗滌等方法，親和層析法去除內(nèi)毒素具有耗時(shí)、成本高、載體回收率差等缺點(diǎn)。緩沖液洗滌法則是借助超濾或離子交換色譜分離LPS膠束，經(jīng)過多次緩沖液交換洗滌，再用低速離心濃縮病毒培養(yǎng)液的方式去除rAAV載體內(nèi)毒素，該方法目前在部分rAAV血清型中適用。無論哪種方法都有一定的局限性，因此，從源頭上去除內(nèi)毒素至關(guān)重要。
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參考文獻(xiàn)
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