時(shí)間：2021-12-13 熱度：

卒中（Stroke）又稱“中風(fēng)”，是影響人類健康的三大疾病之一，卒中包括缺血性卒中（腦梗死）和出血性卒中（腦出血），其中缺血性卒中占所有卒中的75%-90%，出血性卒中只占10-25%。根據(jù)中國腦卒中流行病研究組發(fā)布的流行病調(diào)查結(jié)果顯示腦卒中是我國成年人致死和致殘的首要原因之一，同時(shí)有年輕化趨勢。卒中后認(rèn)知障礙常見于存活的腦卒中患者，成為突發(fā)性癡呆的重要風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，闡明神經(jīng)功能障礙的分子病理機(jī)制，改善卒中病人預(yù)后，已成為亟需解決的醫(yī)學(xué)-社會難題之一。

來自上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院楊國源教授課題組利用嚙齒類動物腦血管疾病模型，探索小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（microglia/macrophage）和星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）在缺血性卒中和出血性卒中修復(fù)階段不同的神經(jīng)突觸吞噬情況。相關(guān)研究成果于2021年11月26日刊發(fā)在Nature Communications上，題為Stroke subtype-dependent synapse elimination by reactive gliosis in mice

 

 

結(jié)果

 

 

1.不同卒中模型小鼠的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的突觸吞噬作用

 

首先作者構(gòu)建了嚙齒類動物腦血管疾病模型--缺血性卒中（Ischemic stroke）MCAO模型和出血性卒中（Hemorrhagic stroke）ICH模型（圖1），并在卒中后D1、D3、D7和D14用Mac-2吞噬生物標(biāo)志物與Iba-1（小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物）和GFAP（星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物）做共標(biāo)。發(fā)現(xiàn)，在缺血性卒中MCAO模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均發(fā)現(xiàn)了Mac-2，D14有25%的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和50%的星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Mac-2（圖2 Ischemic Stroke）。同樣，在出血性卒中ICH模型小鼠大腦中，也發(fā)現(xiàn)了Mac-2與Iba-1和GFAP共標(biāo)現(xiàn)象（圖2g），D14表達(dá)Mac-2的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞占25%，星形膠質(zhì)細(xì)胞僅占5%（圖2 Hemorrhagic stroke）。 

 

隨后，作者研究了小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中和出血性卒中模型小鼠大腦的突觸吞噬情況。借助免疫熒光染色以及透射電鏡（TEM）技術(shù)發(fā)現(xiàn)，兩種膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性腦卒中小鼠中吞噬神經(jīng)突觸（圖2b-d,f）；在出血性腦卒中只有小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)突觸吞噬（圖2h-j,l）。

 

 

圖1 嚙齒類動物腦血管疾病模型構(gòu)建

 

 

圖2 不同卒中模型小鼠的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的突觸吞噬作用

 

接下來，研究人員借助AAV病毒載體分別將表達(dá)抑制性突觸后熒光吞噬報(bào)告元件（AAV-hsyn-Gephyrin-mCherry-eGFP）和興奮性突觸后熒光吞噬報(bào)告元件（AAV-hsyn-PSD95-mCherry-eGFP）注射到小鼠紋狀體。GFP（pKa 6.0）和RFP（pKa 4.5）對溶酶體環(huán)境的敏感性不同。溶酶體水解酶首先降解GFP，使GFP熒光在溶酶體中減弱，而RFP在溶酶體中是穩(wěn)定存在的?；谶@一原理，研究人員發(fā)現(xiàn)，腦缺血小鼠中抑制性突觸后（InhiPost）和興奮性突觸后（ExPost）均被小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞吞噬（圖3 Ischemic Stroke）；腦出血小鼠中大多數(shù)InhiPost和ExPost被小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞吞噬，星形膠質(zhì)細(xì)胞無明顯作用（圖3 Hemorrhagic stroke）。

 

 

圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞吞噬卒中小鼠的興奮性和抑制性突觸

 

上述結(jié)果提示了，小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中小鼠中過度激活從而吞噬神經(jīng)突觸；而在出血性卒中小鼠中只有小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞過度激活介導(dǎo)突觸吞噬，星形膠質(zhì)細(xì)胞無明顯作用。

 

 

2.反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞是通過MEGF10/MERTK通路對膠質(zhì)增生區(qū)域的突觸進(jìn)行吞噬

 

 

MEGF10和MERTK是高度定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞中的吞噬受體，具有高度保守性，MEGF10和MERTK可識別興奮性突觸和抑制性突觸所呈現(xiàn)的吞噬信號啟動吞噬過程。

 

基于此，研究人員探討了卒中后不同時(shí)間段MEGF10和MERTK表達(dá)及定位情況（圖4a,k），借助Western blot等技術(shù)手段發(fā)現(xiàn)，卒中后14天，在反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)MEGF10和MERTK表達(dá)顯著增加（圖4）。

 

 

圖4 小鼠缺血性和出血性卒中后MEGF10和MERTK表達(dá)水平的上調(diào)

 

進(jìn)一步，作者借助條件性基因敲除小鼠和TEM觀察發(fā)現(xiàn)，缺血性卒中14天后，特異性在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞中敲除MEGF10基因（MEGF10^KO）或MERTK基因（MERTK^KO）導(dǎo)致反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)突觸吞噬減少；同樣地，在出血性卒中后14天，MEGF10^KO或MERTK^KO小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞介導(dǎo)突觸吞噬能力下降（圖5）。

 

圖5 MEGF10^KO或MERTK^KO小鼠卒中后膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)突觸吞噬能力下降

 

 

3.反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除MEGF10或MERTK基因可改善神經(jīng)功能障礙

 

研究人員借助高爾基染色進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，特異性在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞敲除MEGF10基因（MEGF10^KO）或MERTK基因（MERTK^KO），有助于改善缺血性卒中后的樹突棘結(jié)構(gòu)；而在出血性卒中后只有特異性在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞敲除MEGF10基因（C-MEGF10^KO）或MERTK基因（C-MERTK^KO）可增加神經(jīng)突觸密度，而星形膠質(zhì)細(xì)胞無明顯作用（圖6）。

 

 

圖6 反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞特異性敲除MEGF10或MERTK基因改善小鼠卒中后樹突棘密度

 

接下來，研究人員探討了小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)突觸吞噬對小鼠卒中預(yù)后的影響。MEGF10^KO或MERTK^KO 小鼠MCAO造模后14天，發(fā)現(xiàn)腦萎縮面積降低（圖7a-d）；此外，ICH造：14天，C-MEGF10^KO或C-MERTK^KO 小鼠由出血性卒中導(dǎo)致的心室擴(kuò)大現(xiàn)象得到改善（圖7e-h）。

 

同時(shí)，神經(jīng)功能缺損評分（ mNSS）、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（rotarod test）、穿梭箱被動回避（step-through passive avoidance test）行為學(xué)范式結(jié)果發(fā)現(xiàn)，特異性在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞敲除MEGF10基因或MERTK基因，有助于改善由缺血性卒中造成的神經(jīng)功能行為障礙；而在出血性卒中后只有特異性在小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞敲除MEGF10基因或MERTK基因可改善行為障礙（圖8）。

 

 

圖7 特異性敲除MEGF10或MERTK基因改善由MCAO導(dǎo)致的腦萎縮及ICH導(dǎo)致的心室擴(kuò)大現(xiàn)象

 

 

圖8 特異性敲除MEGF10或MERTK基因改善由卒中導(dǎo)致的行為障礙

 

 

4.反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同卒中模型中的吞噬相關(guān)基因表達(dá)

 

基于上述結(jié)果，研究人員最后借助單細(xì)胞測序分析發(fā)現(xiàn)，與缺血性卒中相比，出血性卒中后介導(dǎo)神經(jīng)突觸吞噬的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群數(shù)量明顯降低（圖9）。

 

 

圖9 缺血性腦卒中與出血性腦卒中星形膠質(zhì)細(xì)胞吞噬相關(guān)基因表達(dá)差異

 

 

結(jié)論

腦損傷后的神經(jīng)突觸再生和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重塑是神經(jīng)損傷修復(fù)的關(guān)鍵，在卒中后1-2周，神經(jīng)突觸再生到達(dá)峰值，此時(shí)活化增殖的膠質(zhì)細(xì)胞可形成反應(yīng)性膠質(zhì)增生區(qū)域；膠質(zhì)增生對于神經(jīng)突觸再生是有益還是有害的，一直都是充滿爭議的科學(xué)問題。楊國源教授團(tuán)隊(duì)借助疾病動物模型、條敲鼠、免疫熒光染色、TEM、病毒載體、單細(xì)胞測序等技術(shù)手段研究證明了小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過MEGF10和MERTK這兩個(gè)關(guān)鍵分子吞噬神經(jīng)突觸，導(dǎo)致神經(jīng)突觸丟失和神經(jīng)環(huán)路破壞，最終造成神經(jīng)功能障礙。而抑制膠質(zhì)細(xì)胞吞噬能顯著增加損傷周邊區(qū)的神經(jīng)突觸密度，減輕小鼠腦損傷，改善小鼠的運(yùn)動和認(rèn)知功能。鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在不同卒中類型中介導(dǎo)突觸吞噬的差異性，針對不同腦卒中病理階段，開發(fā)精準(zhǔn)有效治療策略，將大大促進(jìn)腦血管病的預(yù)后。

 

 

上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士生施曉婧、碩士生羅龍龍（現(xiàn)在瑞典KTH攻讀博士）、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科主治醫(yī)生王繼先博士為論文的共同第一作者，韓國科學(xué)技術(shù)院助理教授Won-Suk Chung、上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院助理教授湯耀輝和講席教授楊國源為論文的共同通訊作者。該研究工作得到了國家科技部、自然科學(xué)基金委、上海市科學(xué)技術(shù)委員會、上海市教育委員會等項(xiàng)目的支持。

 

九游會j9生物有幸提供實(shí)驗(yàn)中使用的AAV載體，用實(shí)際行動助力中國腦科學(xué)的發(fā)展。