九游會(huì)j9雙十一?科研不缺席 | 雙螢光素酶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)——機(jī)制研究的利器
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雙螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)介紹
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應(yīng)用介紹
miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結(jié)合位點(diǎn)突變型）序列構(gòu)建至載體中報(bào)告基因F-Luc的3’端，通過(guò)比較過(guò)表達(dá)miRNA后，報(bào)告基因表達(dá)的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），來(lái)確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
轉(zhuǎn)錄因子主要通過(guò)作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用，將目的基因啟動(dòng)子區(qū)序列替換報(bào)告基因F-Luc的啟動(dòng)子，通過(guò)共表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子后，報(bào)告基因表達(dá)的改變，來(lái)確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)靶基因的作用。
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技術(shù)路線
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常見(jiàn)應(yīng)用方向總結(jié)
● 驗(yàn)證miRNA同mRNA靶向互作。將靶mRNA的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該miRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。
● 驗(yàn)證miRNA同circRNA靶向互作。將circRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。
● 驗(yàn)證miRNA同lncRNA靶向互作。將lncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素酶活性。
● 啟動(dòng)子活性分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，再分別構(gòu)建入報(bào)告基因載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。
● 驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同啟動(dòng)子的作用。將啟動(dòng)子區(qū)域插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)該轉(zhuǎn)錄因子，分析轉(zhuǎn)錄因子過(guò)表達(dá)是否提高螢光素酶活性。
● 分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。
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